专利成果：非洲猪瘟病毒（ASFV） LAMP现场可视化快速检测试剂盒

2019-04-11

非洲猪瘟病毒（ASFV） LAMP现场可视化快速检测试剂盒

上海博满生物科技有限公司

1  研究的必要性

非洲猪瘟（African Swine Fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病，致死率100%。自2018年8月宁省沈阳市发生第一起非洲猪瘟疫情起，目前全国已有29个省115个地方发生非洲猪瘟疫情，已扑杀数百万头生猪，直接经济损失数百亿元。目前全世界都没有有效的非洲猪瘟疫苗进行预防，现在有效的防控方法仍然是对非洲猪瘟病毒进行检测，根据检测结果，对发生疫情的地方严防死守，对疫点地区生猪全部扑杀，进行无害化处理，防止疫情的扩散。

2  ASFV检测方法的局限性

目前, ASFV 的诊断主要依靠免疫学检测技术和分子生物学检测技术。由于免疫学技术自身敏感性和特异性较差, 因此分子生物学检测技术得到了迅速的发展。

2-1  PCR技术

PCR技术是一种常规的分子生物学检测技术。但是易导致假阳性或假阴性结果出现；

2-2  ELISA检测

由于抗原抗体反应的专一性，每种基因产品都要开发和建立专门的检测试剂和方法，要建立所有基因产品的蛋白质检测法工作量很大；

2-3  基因芯片

基因芯片检测不仅需要昂贵的芯片制作系统，操作复杂、费时，对操作人员的专业素质要求比较高，容易造成样品污染；

2-4  荧光定量PCR

由世界动物卫生组织（OIE）推荐的非洲猪瘟病毒检测方法。该方法准确可靠，但该方法复杂，需要昂贵的仪器，熟练的操作人员和专业的实验室,时间长；

2-5  金标试纸条

可进行现场可视化检测，但需要制备单克隆抗体。工作量巨大，且有些蛋白是做不出抗体的，生产工艺复杂。研发成本和生产成本都很高，敏感性和特异性比核酸检测要低的多。临床上，检测结果要与患者病史和临床症状一起进行综合判断；

3  环介导等温扩增（LAMP）

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification， LAMP）是一种通过链置换的等温核酸扩增技术，无需温度循环变化。LAMP技术具有以下五个方面的优点：

特异性强，能获得比PCR更高的特异性

3-1  灵敏度高，比PCR灵敏度高10-100倍

3-2  速度快，在30-60分钟内即可完成反应过程

3-3  成本低，易推广

3-4  产物检测便捷，可以进行现场可视化快速检测

4  试剂盒的研制

欧洲毒株基因（即格鲁吉亚2007/1株）与报道的中国辽宁省沈阳市沈北新区某养殖场发生的非洲猪瘟病毒序列完全匹配，以此为靶序列序列构建非洲猪瘟病毒质粒，设计LAMP引物F3、B3、LF、LB、FIP、BIP。进行温度优化、引物优化、体系优化、灵敏度试验、试剂盒组装、样品检测。

4-1  温度优化

4-2  引物优化

4-3  体系优化

4-4  灵敏度试验

4-5  特异性实验

非洲猪瘟病毒的临床症状与猪瘟、高致病性蓝耳病、猪丹毒和败血型沙门氏菌临床症状一样，临床上难以区分。试剂盒特异性检测表明，ASFV与猪瘟病毒、高致病性蓝耳病病毒、猪丹毒杆菌和败血型沙门氏菌无交叉反应。

4-6  荧光显色

反应前加入荧光染料，反应后在紫外下，阳性样品为绿色，阴性样品为橘红色。

5  试剂盒的组装

非洲猪瘟病毒检测试剂盒主要包括A液和B液，在工厂中将A液风干在PCR管盖上做成半成品，将B液加入PCR管内，封盖，做成半成品，封装。

6  试剂盒的使用方法

6-1  模板制备

液体样品直接作为模板加入，无需纯化；固体样品加入裂解液中制备，只需10分钟，直接作为模板加入，无需纯化。

6-2  加入模板 AB液混合

使用时，加入模板在B液后，将装有A试剂的管盖盖在B管上，倒置2min，与B液混合，上下颠倒五次混匀，放入金属浴中进行DNA扩增。

6-3  观察结果

DNA扩增完成后，无需开盖，根据显色剂，直接观察结果，显色为双显色系统，在日光下，阴性为紫罗兰色，阳性样品为天蓝色；也可使用荧光显色仪观察结果，阳性为绿色，阴性为橘红色，以防止含有抗凝血剂的血清样品产生假阳性。

7  试剂盒应用优势

7-1  检测时间：20分钟；特异性：与其它病毒、细菌无交叉反应；灵敏度：2拷贝。

7-2  现场操作步骤简单，高中生即可操作，只需加样一次，DNA扩增后，无需开盖，可直接显色可视化判断结果，减少污染风险。

7-3  保存时间长，室温存放7个月，可常温运输，避免了冷链运输。

7-4  液体样品直接作为模板加入，无需纯化；固体样品加入裂解液中制备，只需10分钟，直接作为模板加入，无需纯化。

7-5  设备简单，只需一台金属浴，3把移液器，总费用6千元。试剂成本低，一头份试剂成本只需一元。

8  试剂盒应用前景

目前全世界都没有有效的非洲猪瘟疫苗进行预防，现在有效的防控方法仍然是对非洲猪瘟病毒进行检测，根据检测结果，对发生疫情的地方严防死守，对疫点地区生猪全部扑杀，进行无害化处理，防止疫情的扩散。农业部要求猪场、饲料厂和屠宰厂和流通环节必须进行非洲猪瘟病毒检测。猪场、饲料厂、屠宰厂和流通环节用我们的ASFV LAMP现场可视化快速检测试剂盒对非洲猪瘟病毒进行现场检测。根据检测结果，对发生疫情的地方严防死守，对疫点地区生猪全部扑杀，进行无害化处理，防止疫情的扩散。从而对非洲猪瘟进行有效的防控。最大限度减少养殖户经济损失

成果转让：

独家转让500万元，另占30%股份。

联系人：赵凯

联系电话： 13611934873

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